Hạn hán đang là một trong những vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà còn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Tình trạng hạn hán trầm trọng ảnh hưởng không nhỏ tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới như Argentina. Thống kê cho thấy sản lượng đậu tương của nước này vào vụ mùa năm 2009 giảm từ 34,5 triệu tấn so với cùng thời điểm này năm 2008 là 46,2 triệu tấn. Ở Việt Nam, tình hình thiếu nước trầm trọng tại các địa phương làm cho sản lượng đậu tương của năm 2009 giảm xuống chỉ còn 213,6 nghìn tấn so với năm 2007 là 275,2 nghìn tấn và năm 2008 là 267,6 nghìn tấn (http://www.gso.gov.vn). Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả năng chịu hạn kém. Chính vì vậy nghiên cứu tạo giống đậu tương nhằm cải thiện khả năng sống trong điều kiện bất lợi về nước là yêu cầu của thực tiễn và đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm của các nhà chọn giống.

Đặc tính chịu hạn của cây đậu tương liên quan đến nhiều gen và biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của cây đậu tương bao gồm (i) các gen chức năng (ví dụ: gen HSP, gen chaperonin, gen LEA, gen LTP, gen P5CS…. Mà sản phẩm của nó liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn và (ii) các gen điều khiển hoạt động phiên mã mà sản phẩm của nó có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen chức năng thông qua tổng hợp nhân tố phiên mã và các nhân tố phiên mã đã bám vào trình tự DNA điều khiển trên vùng khởi động gen (promoter) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi động quá trình phiên mã của các gen chức năng. Nhóm gen điều khiển mã hóa các nhân tố khởi đầu phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương bao gồm DREB, NAC, ZFHD, AREB, MYB, MYC… Trong đó DREB (Dehydration-responsive element-binding) là một họ protein, là nhân tố phiên mã tham gia tích cực vào quá trình chống chịu với các điều kiện bất lợi của môi trường bằng cách kích hoạt sự hoạt động của các gen tham gia trực tiếp chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường như hạn hán, mặn và lạnh. Nhóm DREB bao gồm: DREB1, DREB2, DREB3, DREB4, DREB5.

Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chịu hạn đã được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương. Những giống đậu tương này được chọn tạo chủ yếu bằng phương pháp gây đột biến, lai tạo và chọn lọc từ quần thể. Tuy nhiên các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có quần thể đủ lớn và thường không ổn định. Những nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống đậu tương truyền thống có thể giải quyết được bằng việc áp dụng các tiến bộ của công nghệ gen, trong đó có kỹ thuật chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefacien tumefaciens.  

(1) Tạo được vector mang cấu trúc gen DREB2 phục vụ tạo cây chuyển gen kháng hạn.

(2)  Đánh giá hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá mô hình

Nội dung 1. Phân lập gen DREB từ mRNA của cây đậu tương

(1) Thu thập thông tin về nhóm gen DREB và nhóm nhân tố phiên mã DREB; về gen DREB2 và protein DREB2;

(2) Thiết kế và tổng hợp cặp mồi PCR nhân gen DREB2 từ cây đậu tương;

(3) Nhân bản gen DREB2 từ mRNA: Tách chiết RNA tổng số, tạo cDNA, khuếch đại gen DREB2 (cDNA);

(4) Tách dòng cDNA gen DREB2: Tạo vector tách dòng tái tổ hợp, biến nạp vào vi khuẩn E.coli DH5a, nhân dòng và tách plasmid tái tổ hợp;

(5) Xác định trình tự gen DREB2 trên thiết bị tự động;

(6) Phân tích trình tự gen DREB2 để khẳng định gen DREB2 đa được phân lập;

(7) So sánh trình tự gen DREB2, protein DREB2 và vùng AP2 được phân lập với các trình tự gen DREB2 đã công bố trên GenBank để đánh giá sự đa dạng của gen DREB2 và nhân tố phiên mã DREB2, vùng AP2.

Nội dung 2. Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen DREB

(1) Lựa chọn vector chuyển gen phù hợp ở thực vật trong điều kiện phòng thí nghiệm;

(2) Tạo vector chuyển gen mang cấu trúc gen DREB2;

(3) Kiểm tra vector tái tổ hợp bằng enzym giới hạn và bằng phản ứng colony-PCR;

Nội dung 3. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefacien mang vector chứa cấu trúc gen DREB2;

(1) Biến nạp vector chuyển gen tái tổ hợp mang gen DREB2 vào Agrobacterium tumefaciens;

(2) Nuôi cấy và nhân dòng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp;

(3) Chọn dòng Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp bằng colony-PCR;

Nội dung 4. Phát triển hệ thống tái sinh ở cây thuốc lá mô hình và tạo cây chuyển gen

(1) Lây nhiễm Agrobacterium tumefacien tái tổ hợp vào mô thuốc lá;,

(2) Phát triển hệ thống tái sinh cây thuốc lá từ lá và từ một vài bộ phân khác;

(3) Sử dụng hệ thống chọn lọc mô, chồi chuyển gen;

(4) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc DREB2.

Nội dung 5. Kiểm tra kết quả biến nạp và hoạt động của cấu trúc gen DREB2 trong cây thuốc lá mô hình. Phân tích cây chuyển gen

(1) Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển DREB2 bằng phản ứng PCR;

(2) Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển DREB2 bằng RT-PCR;

(3) So sánh khả năng chịu hạn của dòng cây chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen.

Tải file Thiết kế vector mang cấu trúc gen DREB2 phục vụ chuyển gen kháng hạn ở cây đậu tương tại đây

(i) Thu thập thông tin về gen DREB2, thiết kế cặp mồi PCR nhân gen DREB2

(ii) Phương pháp sinh học phân tử: tách chiết RNA tổng số, tổng hợp cDNA từ mRNA bằng kỹ thuật RT-PCR, tách dòng và xác định trình tự gen DREB2 của cây đậu tương;

(iii) Thiết kế vector chuyển gen chứa gen DREB2 theo phương pháp được mô tả theo Sambrook và công sự 1998.

(iv) Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật: Phát triển hệ thống tái sinh cây thuốc là từ các mảnh lá.

(v) Biến nạp, kiểm tra kết quả biến nạp và đánh giá hoạt động của vector mang gen DREB2 ở cây thuốc lá. Phân tích cây thuốc lá chuyển gen bằng PCR và RT-PCR.

(vi) Đánh giá khả năng chịu hạn của dòng cây chuyển gen so với cây đối chứng trong điều kiện hạn nhân tạo;

(vii) Phương pháp phân tích số liệu thống kê bằng phần mềm Excel. Phân tích trình tự gen bằng phần mềm BioEdit và DNAstar. So sánh trình tự gen, trình tự amino acid của protein bằng phần mềm Megalign.

Hiệu quả về Giáo dục và đào tạo: (i) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu khoa học sẽ được sử dụng trong giảng dạy các chuyên đề cho hệ đào tạo thạc sĩ; (ii) Tham gia đào tạo 01NCS; đào tạo 02 thạc sĩ và 02 đề tài NCKH của sinh viên; (iii) Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu phục vụ nghiên cứu, đào tạo ngành Sinh học và Công nghệ Sinh học tại ĐH Thái Nguyên.

Hiệu quả về kinh tế - xã hội: (i) Vector mang cấu trúc gen DREB điều khiển hoạt động của nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn có thể chuyển vào các đối tượng cây trồng khác. (ii) Các kết quả nghiên cứu là cơ sở phát triển các kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chống chịu của cây trồng tại các phòng thí nghiệm thuộc trường Đại học Sư phạm và Đại học Thái nguyên.

Khoa Sinh –Kỹ thuật nông nghiệp, Trường Đại học sư phạm-ĐH Thái Nguyên;